PEWARNAAN BAKTERI

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

PERCOBAAN 3

PEWARNAAN BAKTERI

A.  Tujuan Percobaan

Mahasiswa dapat mengetahui cara pewarnaan bakteri dan dapat membedakan bakteri gram positif dan gram negatif melalui pewarnaan gram.

B.  Dasar Teori

Bakteri marupakan organisme yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Bakteri rata-rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjangnya hingga 10 mikron. Itu berarti pula bahwa jasad renik ini tipis sekali sehingga tembus cahaya. Akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya.

Komponen dan ketebalan lapisan-lapisan pada dinding sel untuk bakteri gram positif dan bakteri gram negatif berbeda. Ada perbedaan lain selain sifat dinding sel antara sel selain sifat dinding sel antara sel bakteri gram positif dengan sel bakteri gram negatif.Untuk melihat bakteri dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan zat warna, zat warna ini disebut pengecatan bakteri.

Pengecatan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan berkembangnya mikrobiologi di pertengahan abad ke-19 leh Luis Pasteur dan Robert Koch, pada umumnya ada dua macam zat warna yang sering dipakai, yaitu sebagai berikut :

1.    Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam bentuk garam natrium

2.    Zat warna bersifat alkalis, dengan komponen warna kation, biasanya dalam bentuk klorida.

Setelah dilakukan pengecatan, dalam tubuh bakteri akan terjadi proses pertukaran ion-in zat warna dengan ion-ion protoplasma (misalnya asam nukleat) bakteri.

Pada umumnya, larutan-larutan zat warna yang digunakan adalah larutan encer, jarang leih dari 1%. Larutan encer yang dibiarkan berkontak agak lama dengan bakteri bekerja lebih baik dari larutan pekat dengan waktu yang singkat.Untuk mendapatkan hasil pengecatan yang lebih baik, tidak jarang diperlukan bahan penolong, yang biasanya disebut pemantek (mordant). Pemantek ini dapat diartikan sebagai suatu zat yang sanggup bergabung dengan komponen zat warna tertentu, sehingga terbentuk senyawa yang tidak dapat larut dan melekat pada tubuh bakteri. Pemantek dapat diberikan dalam berbagai keadaan yaitu sebagai baerikut.

1.      Sebagai penambahan bahan cat,

2.      Dimasukkan ke dalam larutan bahan cat, dan

3.      Diberikan antara pemakaian dan laruta bahan cat

Bahan-ahan yang dapat dipakai sebagai pemantwk antara lain adalah amonium oksalat, fenol, asam tanat, garam-garam alumunium, besi, timah, seng, tembaga, krom, dll. Cara-cara pengecatannya adalah

1.      Pengecatan sederhana

Tujuan pengecatan ini ialah untuk membedakan bakteri dari benda-benda mati lain yang bukan bakteri dan untuk malihat bentuk dan ukurannya. Larutan cat hanya terdiri dari satu bahan cat yang dilarutkan dalam suatu bahan pelarut. Bahan-bahan yang banyak dipakai untuk keperluan ini adalah karbol fuksin, kristal, violet dan methylen blue.

2.      Pengecatan Diferensial

Untuk pengecatan ini digunakan lebih dari satu macam bahan cat. Dengan dicampur dan digunakan dalam satu larutan. Dua macam pengecatan yang terpenting dari golongan ini ialah pengecatan gram dan pengecatan tahan asam seperti pengecatan Ziehl-Naelsen.Sediaan (preparat) untuk proses pengecatan dibuat sebagai berikut :

a.       Kaca objek dibersihkan, sehingga bebas lemak

b.      Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah permukaan yang tidak di cat

c.       Dengan ose dibuat film yang tipis pada permukaan yang telah dibersihkan.

d.      Film dikeringkan di udara atau dengan hawa hangat dari api gas

e.       Fiksasi dilakukan dengan cara menyentuhkan permukaan kaca objek tiga kali berturut-turut pada ujung api bensin

f.       Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk di cat.

g.      Yang dimaksud fiksasi adalah melekatkan bakteri pada kaca objek, mamatikan bakteri dengan cepat agar sifat-sifatnya tidak banyak berubah. Fiksasi ini harus dilakukan setelah preparat kering.

3.    Pengecatan Gram

Pengecatan ini pertama kali dikemukakan oleh Christian Gram (1884). Dengan pengecatan film bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbl gentinviolet (karbol kristal violet, karbol metil violet) dan didiamkan beberapa lama, kemudian disiram dangan larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pengecatan ini selesai, semua bakteri akan terwarna ungu. Selanjutnya, preparat didekolorisasi dengan alkohol atau campuran alkohol dan aseton sampai semua zat warna tampak luntur dari film. Setelah dicuci dengan air, preparat diberi warna kontras seperti safranin, karbolfuksin encer, air fuksin, tengguli Bismack, atau pironin B.Diantara bermacam-macam bakteri yang dicat, ada yang dapat menahan zat warna ungu (metiviolet, kristalviolet, gentianviolet) dalam tubuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol atau aseton. Dengan demikian tubuh bakteri itu tetap berwarna ungu meskipun disertai dengan pengecatan oleh zat warna kontras kontras, warna ungu itu tetap dipertahankan. Bakteri yang memberi reaksi semacam ini dinamakan bakteri gram positif, sebaliknya bakteri yang tidak dapat manahan zat warna setelah didekolorisasi dengan alkohol akan kembali

menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan zat warna kontras, akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan bakteri gram negatif.

Tabel Ikhtisar pengecatan gram

Perlakuan	Waktu	Hasil pada Bakteri
		Gram +	Gram -
Kristalviolet Cuci dengan air	30 detik	ungu	Ungu
Larutan iodium Cuci dengan air dan keringkan	30 detik	-	-
Dekolrisasi dengan alkohol Cuci dengan air dan keringkan	20 detik	ungu	Warna luntur
Zat warna kontras Cuci dengan air dan keringkan	30 detik	ungu	Warna kontras

Atas dasar pengecatan Gram ini dunia bakteri dibagi dalam dua golongan besar, yaitu bakteri Gram Positif dan bakteri Gram Negatif.

Hasil yang terbaik dari pengecatan Gram ini dapat diperoleh dengan menggunakan zat-zat warna dari glongan pararosalina, seperti metilviolet dan kristalviolet (tetrametilpararosalina). Dalam perdagangan nama ini biasanya diberikan pada campuran bermacam-macam senyawa tetrapenta-, dan heksa metilpararosalina.

Pada umumnya tidak semua benda hidup yang selnya memilki kesanggupan untuk menahan zat warna sewaktu dekolorisasi pada pengecatan gram, tetapi hanya terbatas pada semua jenis ragi dan bakteri. Sel-sel tumbuhan  tingkat tinggi dan hean tidak memakan zat warna pada dekolorisasi alkohol. Reaksi Gram bukanlah suatu ketentuan mutlak. Reaksi ini dapat berubah menurut umur biakan, pH medium, dan sebab-sebab lain. Menurut Bartholonew dan Mittwer (1952) sinar ultraviolet dari 2537 angstrom menyebabkan organisme Gram negatif, maka besar kemungkinan sinar-sinar ultraviolet itu mempunyai pengaruh destruktif terhadap sel-sel mikroorganisme tersebut.

Ciri-ciri khas dari bateri Gram Positif dan Gram Negatif pada fenomena pengecatan

No	Bakteri Gram Positif	Bakteri Gram Negatif
1.	Sangat sensitif terhadap zat warna trifenilmetan	Kurang sensitif terhadap zat warna trifenilmetan
2.	Sensitif terhadap penisilin	Sensitif terhadap streptomisin
3.	Resisten terhadap alkali, tidak larut oleh 1% KOH	Sensitif terhadap alkali; larut oleh 1% KOH
4.	Biasanya kokus atau batang pembentuk spora (kecuali Lactobacillus, Corynebacterium)	Biasanya batang tidak membentuk spora (kecuali Neisseria yang berbentuk kokus)
5.	Dapat bersifat tahan asam (acid fast	Tampaknya tidak pernah tahan asam

4.    Pengecatan Tahan Asam

Pengecatan ini disebut penegcatan tahan asam, karena pada beberapa jenis bakteri sukar dilakukan pengecatan, tetapi sekali dapat tercat tidak mudah untuk dilunturkan meskipun dengan menggunakan zat peluntur (decolorizing agent) asam (asam alkohol). Yang termasuk pada golongan bakteri yang sukar dicat adalah dari genus Mycobacterium smegmatis). Berbagai teori telah dikemukakan untuk menerangkan sifat tahan asam ini, antara lain dinyatakan bahwa sifat tahan asam ini ditentukan oleh adanya sifat permeabilitas yang selektif dari membran sitoplasma. Menonjolnya warna merah disebabkan oleh penyerapan warna karbolfuksin yang larut dalam sel. Bila sel ini dirusak, maka sifat tahan asam itu pun akan hilang. Bakteri tahan asam sangat banyak mengandung lipida asam lemak, dan kandungan inilah yang mencerminkan sifat tahan asam pada golongan bakteri tersebut antara lain asam mikolat. Cara pengecatan bakteri tahan asam disebut uga pengecatan Ziehl-Neelsen.langkah-langkahnya adalah sbb :

a.       Film bakteri pada kaca objek yang telah difiksasi, disiram  dengan karblfuksin, kemudian dipanaskan sampai keluar uap (tidak sampai mendidih). Pemanansan diulang beberapa kali agar bahan cat tetap hangat kemudian didiamkan selama lima menit

b.      Dekolorisasi dilakukan dengan asam alkohol dalam waktu yang singkat, kemudian cepat dicuci dengan air.

c.       Pengecatan dengan cat kontras dilakukan dengan metilen biru dalam larutan KOH

d.      Setelah dicuci kembali dengan air preparat dikeringkan di udara

5.    Pengecatan Granula Metakromatik

Ada beberapa pengecatan yang baik untuk menonjolkan granula metakromatik ini. Pengecatan yang banyak digunakan adalah pengecatan menurut Neisser dan Albert

a.    Cara pengecatan Neisser

1)   Sebagai bahan cat disediakan tiga macam larutan cat, yaitu larutan bahan cat yang mengandung metilenbiru (A). Larutan bahan cat yang mengandung kristalviolet (B). Larutan bahan cat yang mengandung krisoidin atau tengguli Bismarck atau Bismarck Brown (C).

2)   Untuk pengecatan pertama digunakan larutan A dan B yang dicampur sesaat sebelum pengecatan dalam perbandingan dua bagian larutan A dengan satu bagian larutan B. Lama pengecatan adalah setengah menit

3)   Setelah campuran tersebut dibuang preparat dibilas dengan larutan C, dan larutan ini didiamkan di atas film preparat selama ½-1 menit, kemudian dikeringkan dengan kertas saring

b.    Pengecatan Albert

1)   Preparat dicat dengan larutan cat menurut Albert selama 3-5 menit.

2)   Setelah dicuci dengan air, preparat disiram dengan larutan iodium dan ditunggu satu menit. Kemudian dicuci kembali dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring.

c.       Hasil Pengecatan

1)      Pada penegcatan Neisser

Granula berwarna biru-hitam, sitplasma berwarna kuning (krisoidin) atau tengguli (Bismarck Brown)

2)      Pada pengecatan Albert

Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma hijau.

Granula plifosfat timbul pada sel-sel yang sudah tua dan tidak ditemukan pada sel-sel yang sedang aktif membelah. Hal ini memberikan kesan bahwa granula itu adalah tempat persediaan polifosfat untuk digunakan bila sel-sel diaktifkan kembali. Biasanya, pengecatan ini ditunjukkan untuk pengecatan Corynebacterium diphteriae dan karena granula metakromatik itu letaknya biasanya polar, maka dengan pengecatan ini bakteri itu tampak seperti halte. Bentuk semacam ini menjadi tanda khas bagi bakteri difteri, dismaping formasi bentuk huruf V, W, L

6.    Pengacatan Spora

Spora bakteri adalah endospora. Endospora tersebut mudah dilihat sebagai benda intraseluler yang refraktil dalam suspensi sel yang tidak dicat atau sebagai daerah kosong (tidak berwarna) dalam preparat yang dicat secara konvensional. Dinding spora itu relatif tidak permeabel, tetapi zat-zat warna dapat diserapkan ke dalamnya dengan jalan memanaskan preparat tersebut. Sifat tidak permeabel ini mencegah dekolorisasi spora oleh alkohol bila diperlakukan dalam waktu yang sama seperti pada dekolorisasi sel-sel vegetatif. Bagian vegetatif sel ini dapat dicat dengan warna kontras. Spora biasanya dicat dengan zat warna hijau atau karbolfuksin.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam mempelajari spora dari preparat pengecatan adalah sbb

a.       Letak spora dalam sel kemungkinannya adalah sebagai terminal, subterminal, atau sentral

b.      Bentuk spra bulat atau lonjong

c.       Adanya spora dapat mengubah bentuk sel. Dalam hal letak spora terminal bila terdapat spora yang mengubah bentuk bakteri, dan spora menonjol keluar, maka bentuknya seperti pemukul tambur (Clostiridium tetani). Bila letaknya sentral atau subterminal, dan diameter spora lebih besar dari diameter sel bakteri amak bbentuknya seperti kumparan.

Pembentukan spora bakteri hanya terdapat pada beberapa spesies saja, khususnya yang termasuk famili Bacillaceae. Famili ini terdiri dari tiga genera, yaitu sbb :

a. Genus Bacillus atau Sporolactobacillus yang hidupnya aerob

b. Genus Clstridium yang hidupnya anaerob

c. Genus Sporosarcina dari golongan kokus yang aerob

7.    Pengecatan Kapsul

Beberapa jenis bakteri dapat membentuk zat lendir di sekitar tubuhnya. Kadang-kadang lendir ini menjadi padat, sehingga merupakan bentuk yang tetap sebagai lapisan luar. Lapisan ini dikenal sebagai kapsul. Kapsul tidak mempunyai afinitas yang besar terhadap bahan-bahan cat basa. Beberapa kapsul mudah rusak oleh gangguan mekanis atau larut bila dicuci dengan air. Karena kapsul dari berbagai spesies berbeda dalan susunan zat-zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dengan proses pengecatan yang sama. Beberapa cara pengecatan telah dikemukakan dalam usaha memperlihatkan adanya kapsul antara lain ialah sebgaai berikut

a.       Cara pengecatan negatif

1)      Satu Ose suspensi bakteri diletakan pada ujung kaca objek.

2)      Di samping suspensi bakteri diletakkan satu ose tinta cina

3)      Dengan salah satu sudut objek yang bertepi rata kedua tetes tersebut dicampur, kemudian dengan tepi kaca objek yang rata dibuat preparat oles dengan film suspensi campuran yang tipis

4)      Setelah dikeringkan dan difiksasi, film disiram dengan larutan karbolfuksin yang telah diencerkan sepuluh kali, dan ditunggu selama 10 menit.

5)      Selanjutnya larutan cat yang berlebihan dibuang, dan preparat dikeringkan dengan kertas saring

Hasil pengecatan ini memperlihatkan bakteri berwarna merah, sedang kapsul tampak sebagai daerah kosng disekitar tubuh bakteri, dan latar belakang berwarna gelap. Cara pengecatan negatif ini dikemukakan oleh Burri-Gins

b.    Cara Pengecatan Kapsul

Untuk mengecat kapsul telah dikemukakan beberapa cara, satu diantaranya adalah menurut Tyler

1)      Cara Pengecatan Tyler

Ø  Film suspensi pada kaca ojek setelah difiksasi dicat degan campuran yang terdiri dari ; kristalviolet 0,118 gr; asam asetat glasial 0,25 ml; air suling 100 ml selama enam menit

Ø  Dengan hati-hati preparat dicuci dengan larutan tembaga sulfat (20%) secara cepat, kemudian dikeringkan dengan kertas saring.

Pada pengecatan ini kapsul tampak seagai daerah berwarna biru-ungu di sekitar tubuh bakteri, sedang bakterinya sendiri berwarna biru kelam.

Dalam pembuatan preparat untuk pengecatan kapsul perlu diperhatikan bahwa kapsul itu larut dalam air, sehingga pada pembuatan suspensi hendaknya berhati-hati

Ada tidaknya kapsul ditentukan secara genetik. Pada banyak spesies seringkali ditemukan mutan yang berkapsul di samping yang tidak berkapsul, dan hal lain ini mempengaruhi bentuk koloni pada medium pemiakan, sehingga bentuk koloni pada pembiakan medium tersebut dapat dibedakan manjadi :

Ø  Koloni bakteri berkapsul, disebut “Koloni S” (smooth)

Ø  Koloni bakteri tidak berkapsul, disebut “Koloni R” (Rough)

8.    Pengecatan Flagel

Adanya flagel pada tubuh bakteri menunjukkan bahwa bakteri dapat bergerak sendiri. Flagel ini tidak ditentukan pada semua jenis bakter. Oleh karena itu dapat atau tidak bakteri bergerak digunakan sebagai slaah satu ciri dalam detrminasi jenis bakteri. Flagel sebagai alat penggerak bakteri adalah suatu organ berupa benang yang berpangkal dalam sitoplasma. Flagel ini tidak mudah dapat dilihat dengan mikroskop cahaya, dan tidak tampak dengan pengecatan biasa. Hal ini disebabkan oleh ukuran tebal flagel hanya 10-20 mm, sehingga berada di luar jangkauan penglihatan dengan miroskp cahaya. Untuk dapat melihat flagel dengan cara pengecatan, diadakan cara pengecatan khusus, antara lain menurut Gray, sbb :

a.       Untuk pemantek (mordan) dibuat campuran yang terdiri dari :

1)      Larutan jenuh potasium alum 5 ml

2)      Asam tanat 20% dalam air 2 ml

3)      Larutan jenuh merkuriklrida dalam air 2 ml

Ke dalam campuran ini ditambahkan 0,4 ml larutan jenuh fuksin basa dala alkohol.

1)   Pada kaca objek yang bersih dan bebas lemak dipaparkan setets sir suling seluas kira-kira 2 cm

2)   Dengan jarum diambil sedikit biakan muda bakteri, dan biakan itu disentuh pada permukaan air di beberapa tempat dari kaca objek, kemudian digoyang perlahan-lahan selanjutnya dikeringkan di udara

3)   Perlahan-lahan film disiram dengan larutan pemantek dan tunggu 10 menit, setelah itu dicuci perlahan-lahan dengan air suling

4)   Selanjutnya flagel dicat dengan karbofuksin selama 5-10 menit. Akhirnya dicuci dengan air biasa dan dikeringkan di udara.

Hasil pengecatan yang diperoleh adalah flagel berwarna merah tengguli.

C.  Alat dan Bahan

1.    Alat

a.    Erlenmeyer 100 ml, 4 buah

b.    Gelas ukur 100 ml, 1 buah

c.    Pipet ukur 10 ml. 1 buah

d.   Corong kaca, 1 buah

e.    Bunsen, 1 buah

f.     Pipet tetes, 3 buah

g.    Jarum ose, 1 buah

h.    Bola isap, 1 buah

i.      Botol semprot, 1 buah

j.      Spatula, 1 buah

k.    Glass objek

l.      Cover glass

m.  Mikroskop

n.    Timbangan digital

o.    Nampan

2.    Bahan

a.    Safranin

b.    Kristal violet

c.    Iodium/lugol

d.   Kalium iodid

e.    Alkohol 95%

f.     Aquades

g.    Biakan bakteri

h.    Kapas

i.      Spidol

j.      Steroform

D.  Cara Kerja

1.        Buatlah larutan pewarna dari safranin 0,25 gram, alkohol 95% 10 ml dan aquades 90 ml ke dalam erlenmeyer 100 ml.

2.        Buatlah larutan pewarna dari kristal violet 2 gram, alkohol 95% 20 ml, dan aquades 80 ml ke dalam erlenmeyer 100 ml

3.        Buatlah larutan dari iodium 1 gram,  kalium iodid 2 gram, aquades 300 ml

4.        Lingkari glass objek dengan spidol pada bagian sisinya.

5.        Buatlah sediaan kuman pada glass objek dengan menggunakan jarum ose

6.        Teteskan kristal violet pada sediaan kuman dan biarkan selama 1 menit

7.        Buang sisa larutan kristal violet dari gelas objek.

8.        Teteskan larutan iodium atau lugol pada sediaan dan biarkan selama 1 menit.

9.        Buang sisa larutan lugol dari glass objek.

10.    Lunturkan dengan alkohol 95% selama 10 – 20 detik sampai sisa zat warna hilang.

11.    Bilas sampai bersih dengan aquades

12.    Teteskan dengan larutan safranin pada sediaan dan biarkan selama 20 – 30 detik

13.    Buang sisa safranin dari gelas objek.

14.    Bilas sampai bersih dengan aquades

15.    Setelah kering, amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali

E.     Hasil Pengamatan

Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

Membuat larutan pewarnaan

Membuat preparat sampel bakteri

Melakukan pewarnaan dengan metode stain gram positif dan negatif

Hasil pewarnaan ( Bakteri E. coli gram negatif)

 

F.     Pembahasan

     Dari percobaan yang telah dilakukan dapat dikatakan bahwa pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.

     Pewarnaan terjadi dengan melakukn dua tahap pemberian warna yang pertama yaitu pemberian violet pada bakteri dan pemberian pewarnaan lugol. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

     Tahap yang selanjutnya yaitu penambahan lugol pada bakteri. Lugol  merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol  yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

     Kemudian , 1 tetes alkohol 95% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 95% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

     Lalu diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Diakhir kegiatan pasti selalu memberikan reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objekdengan menggunakan air. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

Dari percobaan yang telah dilakukan setelah bakteri di beri pewarna, ternyata bakteri pada 1 ml air sumurterbuka yang telah dipadatkan terlebih dahulu pada percobaan sebelumnya dapat dikatakan bahwa bakteri tersebut mengalami perubahan warna menjadi merah muda maka dapat dikatakan pada percobaan kali ini teryata bakteri termasuk kedalam golongan bakteri gram negatif.

­­­­­

G.    Kesimpulan

Dari hasil praktikum mengenai pewarnaan gram, maka dapat disimpulkan bahwa :

  1. Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Pewarnaan  Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi kristal violet, iodium , alkohol dan safranin. Teknik pewarnaan tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu.

2.  Bakteri gram negatif ditandai dengan warna merah, sedangkan yang positif berwarna ungu. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.Dinding sel bakteri gram positif mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Sedangkan pada bakteri gram negatif, Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%).

 

DAFTAR PUSTAKA

Boleng, Didimus Tanah. 2015. BAKTERIOLOGI Konsep-Konsep Dasar. UMM Press. Malang.

Anonim. 2015. Pewarnaan Bakteri. https://wikipedia,pewarnaan-bakteri/2015/01 .com. Diakses pada 05 juni 2016 di Samrinda.

Diana Agustina, 2013. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri pada Ikan Kembung (Rastrelliger sp.) Asin Berkitosan. http://Biospecies Vol. 6 No.1, Januari 2013, hal. 15-19. Diakses pada 05 juni 2016 di Samrinda.

Anonim, 2012. Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012. http://dokumen. tips/ Praktikum Mikrobiologi Laut/jurnal-mikro-pewarnaan.com