LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI
PERCOBAAN 2
PENANAMAN BAKTERI DENGAN METODE TUANG (POUR PLATE)
DAN PERHITUNGAN KOLONI BAKTERI
A. Tujuan Percobaan
1.
Mahasiswa
dapat mengetahui cara penanaman bakteri dengan metode tuang (Pour Plate).
2.
Mahasiswa
dapat mengetahui cara perhitungan koloni bakteri setelah penanaman.
B. Dasar
Teori
Bakteri seperti makhlik hidup lainnya, melakukan
reproduksi untuk mempertahankan spesiesnya. Sel bakteri dapat bereproduksi
dengan baik, jika didukung oleh keberadaan nutrisi dan factor-faktor lain yang
dibutuhkan.
Perbanyakan sel bakteri, melalui proses
reproduksinya, menentukan pertumbuhan sel bakteri. Bakteri adalah makhluk
uniseluler. Oleh karena itu, pertambahan jumlah sel bakteri, berarti juga
terjadi pertambahan jumlah individu pada spesies bakteri tersebut.
Cara-cara reproduksi pada mikroorganisme umumnya
secara aseksual, yaitu dengan pembelahan sel. Hasil dari proses pembelahan sel
adalah terbentuknya dua sel anak. Oleh karena itu, jika semua factor
pertumbuhan terpenuhi untuk terjadinya proses pembelahan sel, maka dalam waktu
tertentu, akan dihasilkan sejumlah besar sel anak baru.
Penanaman
bakteri atau biasa
disebut juga inokulasi
adalah pekerjaan memindahkan
bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian
yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih
dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar
tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi.
Sel bakteri yang di inokulasikan kedalam satu medium
pertumbuhan yang optimum, maka dalam waktu singkat, akan terjadi kenaikan
jumlah sel yang cukup tinggi. Dalam rentang waktu yang sama, tidak semua
bakteri mengalami kenaikan jumlah sel yang sama dalam kondisi medium yang sama.
Untuk mendapatkan atau menumbuhkan jenis
mikroorganisme tertentu, maka dilakukan isolasi. Prinsip
dari isolasi mikroba
adalah memisahkan satu jenis
mikroba dengan mikroba lain
yang berasal dari
campuran bermacammacam mikroba.
Dengan menggunakan isolasi ini dapat
diidentifikasikan jenis bakteri tertentu baik dari kelimpahan
maupun morfologinya. Isolasi dapat
dilakukan dengan dua metode yaitu metode
cawan tuang dan metode cawan gores.
Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum
melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :
1. Menyiapkan
ruangan
Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan
keadannya harus steril agar tidak terjadi
kesalahan dalam pengamatan
atau percobaaan .dalam
labotarium pembuataanserum vaksin dan sebagainya.
2. Pemindahan
dengan dengan pipet
Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau
pada penyelidikan untuk diambil 1 tetes contoh yang akan diencerkan oleh air
sebanyak 9 tetes akuades.
3. Pemindahan
dengan kawat inokulasi
Kawat
inokulasi sebaliknya dari
platina atau nikel
.ujungnya boleh lurus juga boleh berupa
kolongan yang diametrnya
1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakterikawat ini
terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyalaapi
saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar,
1986).
Teknik Inokulasi
Ada
beberapa metode yang
digunakan untuk mengisolasi
biakan murni mikroorganisme
yaitu :
1.
Metode gores
Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni :
·
Goresan T
·
Goresan Radian
·
Goresan sinambung
2.
Metode tusuk
3.
Teknik Isolasi Dan Pemurnian
4.
Metode Pengenceran
5.
Metode penanaman pada agar
Metode penanaman pada agar
Pada metode penanaman pada agar, jika sedikit saja
sel diletakkan dalam medium agar, maka tiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang
terpisah. Jika suspensi sel cukup diencerkan, koloni akan terpisah dengan baik,
sehingga masing-masing memiliki kemungkinan tinggi untuk diturunkan menjadi sel
tunggal. Namun untuk membuat yang demikian,
penting untuk mengambil
satu tipe koloni
yang diinginkan, memasukkan ke dalam air dan menanamnya kembali ke agar.
Dengan mengulangi prosedur ini
beberapa kali menjamin
untuk memperoleh biakan murni.
Pengenceran adalah mencampur larutan pekat
(konsentrasi tinggi) dengan cara
menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar.
Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap
hidup merupakan suatu hal yang penting
untuk diketahui. Istilah
pertumbuhan yang digunakan
untuk bakteri dan mikroorganisme biasanya mengacu pada perubahan didalam
hasil panen (pertumbuhan massa sel) dan bukan perubahan individu organisme.
Pertumbuhan mikroorganisme terdiri
dari beberapa fase
yaitu fase adaptasi, pertumbuhan awal, pertumbuhan
logaritmik, pertumbuhan lambat, pertumbuhan tetap (stationer), menuju
kematian, serta fase
kematian. Faktorfaktor yang mempengaruhi pertumbuhan adalah
nutrien, air, pH, suhu dan oksigen.
Mikroba
merupakan organisme yang
sangat kecil. Untuk
mengetahui banyaknya mikroba misalnya bakteri pada suatu sample sangat
tidak mungkin bila kita tidak menggunakan
metode penghitungan. Dalam
dunia mikrobiologi, mikroba seperti
bakteri dapat diperkirakan jumlahnya
dengan suatu metode penghitungan. Terdapat dua metode
penghitungan bakteri yaitu metode hitungan mikroskopis langsung
(direct microscopis count)
dan metode hitungan
tak langsung (indirect count)
dengan hitungan cawan,
baik dengan metode penyebaran maupun metode penuangan.
Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni
dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka
dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada
pada bahan. Jumlah mikroba pada suatu bahan
dapat dihitung dengan
berbagai macam cara, tergantung pada
bahan dan jenis mikrobanya. Ada 2 macam cara
perhitungan jumlah mikroba/bakteri, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak
langsung. Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba
dihitung secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup sedangkan perhitungan jumlah miroba
secara tidak langsung
yaitu jumlah mikroba dihitung
secara keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk menentukan
jumlah mikroba yang hidup saja, ini tergantung cara-cara yang digunakan.
Untuk menentukan jumlah miroba yang hidup dapat
dilakukan setelah larutan bahan atau biakan mikroba diencerkan dengan faktor
pengenceran tertentu dan ditumbuhkan dalam media dengan cara-cara tertentu
tergantung dari macam dan sifat-sifat mikroba. Banyak metode yang digunakan
dalam menaksir secara kuantitatif dari suatupopulasi bakteri. Namun, ada dua
metode yang paling sering digunakan yaitu metode hitung koloni di cawan petri
(standard/viable plate count methode) dan analisa spektrofotometer
/turbidimeter.
Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan
bahwa setiap sel yang hidup dapat berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni
yang muncul padacawan adalah indeks bagi jumlah mikroorganisme yang terkandung
dalam sampel.Teknik yang harus dikuasai dari metode ini adalah mengencerkan
sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi, jumlah
semua koloni diamati untuk memenuhi
persyaratan statistik. Cawan
yang dipilih untuk menghitung koloni adalah cawan yang
mengandung antara 30 sampai 300 koloni. Organisme yang
terdapat dalam sampel
asal ditentukan dengan
mengalikan jumlah koloni yang
terbentuk dengan faktor
pengenceran pada cawan
yang bersangkutan. Alat penghitung koloni disebut colony counter.
Prinsip dari perhitungan metode hitungan cawan
adalah bila sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium, maka mikroba
tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang
dapat dilihat langsung
dan kemudian dapat
dihitung tanpa menggunakan
mikroskop. Metode hitungan cawan dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang
(pour plate) dan metode permukaan (surface spread plate). Pada metode tuang,
sejumlah sampel (1
ml atau 0,1
ml) dari pengenceran
yang dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambhkan
agar-agar cair yang steril
yang telah didinginkan
(47-50oC) sebanyak 15-20
ml dan digoyangkan supaya
sampelnya menyebar. Metode
ini merupakan cara
yang paling sensitif untuk menentukan jumlah jasad renik, dengan alasan
:
a) Hanya
sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung
b) Beberapa
jasad renik dapat dihitung sekaligus
c) Dapat
digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karenakoloni yang
terbentuk mungkin berasal
dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik
Selain keuntungan-keuntungan tersebut di atas,
metode hitungan cawan juga memiliki kelemahan sebagai berikut :
1) Hasil perhitungan
tidak menunjukkan hasil
yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin
membentuk koloni.
2) Medium
dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda
pula.
3) Mikroba
yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang
kompak, jelas, dan tidak menyebar.
4) Memerlukan persiapan
dan waktu inkubasi
relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.
C.
Alat
dan Bahan
1.
Alat
a.
Cawan
petri yang telah disterilkan, 1 pasang
b.
Pipet
ukur 10 ml yang telah disterilkan, 1 buah
c.
Tabung
reaksi 10 ml yang telah diserilkan, 2 buah
d.
Bunsen,
1 buah
e.
Rak
tabung reaksi, 1 buah
f.
Erlenmeyer
300 ml, 1 buah
g.
Erlenmeyer
500 ml, 1 buah
h.
Bola
isap, 1 buah
i.
Inkubator,
1 buah
j.
Colony
Counter, 1 buah
k.
Lemari
Pendingin, 1 buah
l.
Hot
Plate, 1 buah
2.
Bahan
a.
Media
Agar (Mengandung 10 gram Nutrien Agar dan Aquades 500 ml), sebanyak 20 ml.
b.
Air
sumur gelatik, 1 ml
c.
Kapas
d.
Label
e.
Aquades
D.
Prosedur
Kerja
Penanaman bakteri teknik tuang
1. Disiapkan
media agar yang sebelumnya telah dipanaskan dengan hot plate hingga media agar
mencair.
2. Disiapkan
1 cawan petri steril dan 3 tabung reaksi steril.
3. Diberi
label nama pada cawan petri steril yaitu nama ketua kelas.
4. Diberi
label nama pada 3 tabung reaksi steril, yaitu enceran 10-1 pada
tabung reaksi 1, enceran 10-2 pada tabung reaksi 2, dan 10-3
pada tabung reaksi 3.
5. Dimasukan
9 tetes akuades dan 1 tetes air sumur terbuka dari jl. gelatik pada tabung
reaksi pertama dengan menggunakan pipet tetes, kemudian tabung reaksi pertama
dikocok dengan menggunakan tangan di kocok perlahan dan tutup dengan kapas.
6. Diambil
enceran sebanyak 1 tetes pada tabung rekasi pertama dan 9 tetes akuades dengan
mengunakan pipet tetes dimasukan pada tabung reaksi kedua dan dekatkan pada
Bunsen lalu dikocok dengan menggunakan tangan di kocok perlahan dan tutup
dengan kapas.
7. Diambil
enceran sebanyak 1 tetes pada tabung rekasi kedua dan 9 tetes akuades dengan
mengunakan pipet tetes dimasukan pada tabung reaksi ketiga dan dekatkan pada
Bunsen lalu dikocok dengan menggunakan tangan di kocok perlahan dan tutup
dengan kapas.
8. Dituang
media agar kira-kira 2/3 bagian pada cawan petri yang steril yang telah
didekatkan pada Bunsen.
9. Diambil
enceran sebanyak 1 tetes pada tabung reaksi ketiga, kemudian buka cawan petri
yang telah berisi media agar dan dekatkan pada bunsen, diteteskan perlahan
enceran dari tabung reaksi tiga ke cawan petri.
10. Dengan
segera ditutup cawan petri dan diberi label nama kemudian putar membentuk angka
delapan beberapa lama dengan perlahan usahakan media tidak menyentuh bagian
dalam dari tutup cawan petri.
11. Kemudian
media agar didiamakan sampai membeku atau mengental
12. Dibalik
cawan petri kemudian dibungkus dengan kertas HVS dan di inkubasi di dalam
inkubator dengan suhu 37oC.
13. Diamati
pertumbuahan bakteri dan dihitung jumlah koloninya dalam 48 jam.
Penghitungan koloni
1. Disiapkan
media agar yang telah terdapat koloni bakteri untuk dihitung.
2. Disiapkan
kertas HVS dan alat tulis serta colony counter.
3. Diletakan
media agar berkoloni di atas colony counter, kemudian dinyalakan
lampu pada colony counter disesuaikan pencahayaan sesuai keperluan.
4. Setelah
jelas terlihat koloni pada media agar dimulai penghitungan dengan menggunakan
bolpoint yang terdapat pada colony counter dengan memberikan tanda
titik (.) pada permukaan cawan petri yang koloninya tampak.
5. Secara
otomatis colony counter akan menghitung jumlah koloni sesuai titik
yang dibuat, jumlah koloni yang ditemukan pada praktikum ini adalah 114 koloni.
6. Dosen
akan menjelaskan terlebih dahulu cara menghitung jumlah kuman.
E. Hasil
Pengamatan
1.
Gambar
koloni bakteri setelah dikultivasi dengan metode tuang (Pour Plate) dan telah inkubasi
2.
Hasil
perhitungan koloni bakteri
Dari hasil perhitungan dengan colony counter diperoleh
jumlah koloni 144
Tingkat pengenceran 10-2
Rumus jumlah koloni/ml = =
di mana Fp adalah tingkat pengenceran.
Jumlah koloni/ml =
=
= 144
102
F.
Pembahasan
Metode hitungan cawan dilakukan
dengan mengencerkan sampel suspensi bakteri ke dalam nutrisi kaldu agar.
Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada cawan
tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Dimana jumlah terbaik adalah antara
30 sampai 300 sel mikroba per ml, per gram atau per cm permukaan
(Fardiaz,1993). Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin
banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, semakin sedikit jumlah mikroba,
dimana suatu saat didapat hanya satu mikroba pada satu tabung (waluyo, 2004).
Larutan yang digunakan untuk
pengenceran harus memiliki sifat osmotik yang sama dengan keadaan lingkungan
asal mikroba untuk menghindari rusaknya sel, selain itu juga dijaga agar tidak
terjadi perbanyakan sel selama pengenceran. Pengenceran yang dilakukan dalam
percobaan ini adalah pengenceran decimal yaitu 10-1, 10-2,
10-3, 10-4, 10-5 dan 10-6. Dan yang
diplating dan diamati adalah pengenceran 10-5 dan10-6.
Hal ini karena diperkirakan koloni yang dibentuk oleh sampel bakteri berada
pada jumlah yang dapat dihitung pada pengenceran tersebut. Selain itu, untuk
perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan
secara desimal. Selanjutnya dari tabung ke lima dan ke enam dituang ke dalam
cawan petri (penanaman atau plating) dengan media KNA secara aseptik. Plating
atau penanaman bakteri adalah proses pemindahan bakteri dari medium lama ke
medium baru (Dwijoseputro, 1978). Pada penanaman bakteri dibutuhkan kondisi
aseptik atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk menghindari
kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak diinginkan.
Media KNA digunakan karena media
KNA merupakan media yang paling cocok untuk kultur bakteri. Selanjutnya cawan
petri diinkubasikan selama 2 x 24 jam pada suhu 37 ºC. inkubasi dilakukan
selama 2 x 24 jam karena jumlah mikroba maksimal yang dapat dihitung langsung
oleh mata.
Berdasarkan hasil pengamatan
dapat disimpulkan bahwa semakin tingki tinggkat pengenceran yang dilakukan maka
semakin sedikit mikroba yang dapat dihitung. Hal ini dapat dibuktikan dengan
hasil pengamatan pada cawan petri hasil pengenceran kelima yang menghasilkan 7
koloni bakteri sedangkan pada cawan petri hasil pengenceran yang ke enam
terdapat 4 koloni bakteri.
Pada praktikum kita kali ini
didapatkan data yaitu, dari
hasil perhitungan dengan colony counter diperoleh jumlah koloni 144, dan tingkat pengenceran 10-2.
Rumus jumlah
koloni/ml = =
di mana Fp adalah tingkat pengenceran.
Jumlah koloni/ml =
=
=
144
102
Jadi jumlah koloni yang didapatkan pada praktikum kita
adalah 144
102
G.
Kesimpulan
Pada praktikum kita kali ini
didapatkan kesimpulan yaitu:
Dari hasil
perhitungan dengan colony counter diperoleh jumlah koloni 144
Tingkat pengenceran
10-2
Rumus jumlah
koloni/ml = =
di mana Fp adalah tingkat pengenceran.
Jumlah koloni/ml =
=
= 144
102
Jadi jumlah koloni yang didapatkan pada praktikum kita
adalah 144
102
DAFTAR
PUSTAKA
Boleng,
Didimus Tanah. 2015. BAKTERIOLOGI
Konsep-Konsep Dasar. UMM Press. Malang.
DA Pasta et al, 2012. Maspari Journal. DA Pasta et al. / Maspari Journal 04 (2012) 77-82.
Diakses
pada 05 juni 2016 di Samrinda.
Sutiknowati,
Lies Indah, 2013. Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis,
Vol. 5, No. 1, Hlm. 204-218, Juni 2013. Diakses pada 05 juni 2016 di
Samrinda.
Anonim.
2011. Perhitungan Angka Kuman. http://documents.tips/documents/laporan-mikri-perhitungan-angka-kuman.html.
Diakses pada 05 juni 2016 di Samrinda.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar