IDENTIFIKASI SEL DARAH PUTIH MANUSIA

PERCOBAAN II

IDENTIFIKASI SEL DARAH PUTIH MANUSIA

A.    Tujuan

Agar mahasiswa dapat menidentifikasi berbagai macam bentuk sel darah merah putih pada manusia.

B.     Dasar Teori

Sediaan apus darah tepi adalah suatu cara yang sampai saat ini masih digunakan pada pemeriksaan di laboratorium. Prinsip pemeriksaan sediaan apus ini adalah dengan meneteskan darah lalu dipaparkan di atas objek glass, kemudian dilakukan pengecatan dan diperiksa dibawah mikroskop.

Guna pemeriksaan apusan darah:

1.      Evaluasi morfologi dari sel darah tepi (eritrosit, trombosit, dan leukosit)

2.      Memperkirakan jumlah leukosit dan trombosit.

3.      Identifikasi parasit (misal : malaria. Microfilaria, dan Trypanosoma).

Sediaan apus darah tepi dapat diwarnai dengan berbagai macam metode termasuk larutan-larutan yang sederhana antara lain: pewarnaan Giemsa, pewarnaan acid fast, pewarnaan garam, pewarnaan wright, dan lainlain. Pewarnaan Giemsa disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak digunakan untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, sel-sel sumsum dan juga untuk mengidentifikasi parasit-parasit darah misal Tripanosoma, Plasmodia dan lain-lain dari golongan protozoa. ( Maskoeri,  2008).

Pewarnaan Giemsa (Giemsa Stain) adalah teknik pewarnaan untuk pemeriksaan mikroskopis yang namanya diambil dari seorang peneliti malaria yaitu Gustav Giemsa. Pewarnaan ini digunakan untuk pemeriksaan sitogenetik dan untuk diagnosis histopatologis parasit malaria dan juga parasit jenis lainnya. (Jason and Frances, 2010 )

Dasar dari pewarnaan Giemsa adalah presipitasi hitam yang terbentuk dari penambahan larutan metilen biru dan eosin yang dilarutkan di dalam metanol. Yaitu  dua zat warna yang berbeda yaitu Azur B ( Trimetiltionin ) yang bersifat basa dan eosin y ( tetrabromoflurescin ) yang bersifat asam seperti kromatin, DNA dan RNA.

Sedangkan eosin y akan mewarnai komponen sel yang bersifat basa seperti granula, eosinofili dan hemoglobin. Ikatan eosin y pada azur B yang beragregasi dapat menimbulkan warna ungu, dan keadaan ini dikenal sebagai efek Romanowsky giemsa. Efek ini terjadi sangat nyata pada DNA tetapi tidak terjadi pada RNA sehingga akan menimbulkan kontras antara inti yang berwarna dengan sitoplasma yang berwarna biru. ( Arjatmo Tjokronegoro, 1996).

Pewarnaan giemsa adalah teknik pewarnaan yang paling bagus dan sering digunakan untuk mengidentifikasi parasit yang ada di dalam darah ( blood-borne parasite ). (  Ronald dan Richard , 2004  ).

Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari kapiler atau vena, yang dihapuskan pada kaca obyek. Pada keadaan tertentu dapat pula digunakan EDTA (Arjatmo Tjokronegoro, 1996)

Jenis apusan darah :

1.      Sediaan darah tipis

Ciri- ciri apusan sediaan darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal, morfologinya lebih jelas. bentuk parasit plasmodium berada dalam eritrosit sehingga didapatkan bentuk parasit yang utuh dan morfologinya sempurna. Serta lebih mudah untuk menentukan spesies dan stadium parasit dan perubahan pada eritrosit yang dihinggapi parasit dapat dilihat jelas.

2.      Sediaan darah tebal

Ciri- ciri apusan sediaan darah tebal yaitu membutuhkan darah lebih banyak untuk pemeriksaan dibanding dengan apusan darah tipis, sehingga jumlah parasit yang ditemukan lebih banyak dalam satu lapang pandang, sehingga pada infeksi ringan lebih mudah ditemukan. Sediaan ini mempunyai bentuk parasit yang kurang utuh dan kurang begitu lengkap morfologinya. (Sandjaja, 2007).

Giemsa pewarna Giemsa 10% sebagai pewarna yang umum digunakan agar sediaan terlihat lebih jelas. Pewarnaan ini sering disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak dipakai untuk mempelajari morfologi darah, sel-sel sumsum dan juga untuk identifikasi parasit-parasit darah misalnya dari jenis protozoa. Zat ini tersedia dalam bentuk serbuk atau larutan yang disimpan di dalam botol yang gelap. ( Kurniawan,  2010).

Zat warna yang digunakan dalam metode Romanovsky adalah Giemsa yang sebelumnya telah diencerkan dengan aquades. Semakin lama pewarnaan yang dilakukan maka intensitasnya menjadi semakin tua. Preparat apus yang yang telah selesai dibuat kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x. Gambar yang didapat dalam hasil menunjukan sel-sel butir darah baik eritrosit, leukosit, trombosit, atau  jenis parasit yang lain ( Maskoeri,  2008).

Sediaan apus darah secara rutin diwarnai dengan campuran zat warna khusus. Pewarnaan ini disebabkan karena oksidasi methylen blue dan pembentukan senyawa baru dalam campuran yang dinamakan azure. Setelah pemberiaan campuran jenis Romanosky, diferensiasi sel-sel dapat dilakukan Berdasarkan 4 sifat pewarnaan yang menyatakan afinitas struktur sel oleh masing-masing zat warna dari campuran, yaitu:

1.      Afinitas untuk methylen blue

2.      Afinitas untuk azure dikenal sebagai azurefilik ( ungu).

3.      Afinitas untuk eosin (suatu zat warna asam ) dikenal sebagai asidofilik atau eosinofilia.(merah muda kekuningan ).

4.      Afinitas untuk komplek zat warna yang terdapat dalam campuran, secara tidak tepat dianggap netral, dikenal sebagai neutrofilia (salmon-pink smplilac ). (  Safar, 2009).

Giemsa adalah zat warna yang terdiri dari eosin dan metilen azur memberi warna merah muda pada sitoplasma dan metilen biru memberi warna pada inti leukosit . Ketiga jenis pewarna ini dilarutkan dengan metil alkohol dan gliserin. Larutan ini dikemas dalam botol coklat ( 100 – 500 – 1000  cc  ) dan dikenal sebagai giemsa stock dengan pH 7  . (  Depkes RI, 1993  ).

Pedoman pemakaian Giemsa

1.      Giemsa stock baru boleh diencerkan dengan aquadest, air buffer atau air sesaat akan digunakan agar diperoleh efek pewarnaan yang optimal

2.      Encerkan gimesa sebanyak yang dibutuhkan, sebab bila berlebihan terpaksa harus dibuwang.

3.      Untuk mengambil stock giemsa dari botolnya, gunakan pipet khusus agar stock giemsa tidak tercemari.

4.      Methanol dapat menarik air dari udara, sebab itu stock giemsa harus ditutup rapat dan tidak bboleh sering dibuka .

5.      Tolak ukur sebagai dasar perhitungan   :

a.       1cc = 20 tetes

b.      Seluruh permukaan kaca sediaan dapat ditutupi cairan sebanyak 1 cc

c.       Berdasarkan tolak ukur ini dapat dihitung banyaknya giemsa encer yang harus digunakan sesuai dengan kebutuhan terutama bila melakukan pewarnaan.

6.      Takaran pewarnaan, Untuk melakukan pewarnaan  individu pada stock giemsa 1 tetes dapat ditambah  dengan pengencer sepuluh tetes  lama pewarnaan 15 – 20 menit ( giemsa 10 % ) atau stock giemsa 1 tetes ditambah pengencer 1 cc ( 20 tetes ) dengan lama pewarnaan 45 – 60 menit ( giemsa 20 % ) .

7.      Gunakan air pengencer yang mempunyai pH 6.8 – 7.2 ( paling ideal dengan pH 7.2). ( Depkes RI, 1993 ).

Menguji mutu giemsa apakah stock giemsa yang akan digunakan masih baik, perlu diadakan pengujian. Ada 2 cara menguji mutu Giemsa :

1.      Dilakukan pewarnaan sel darah 1- 2  sel darah lalu diperiksa mikroskop. Jika hasilnya dengan kriteria yang ada, berarti giemsa dan air pengencernya masih baik. Pengujian seperti ini perlu dilakukan setiap kali akan melakukan pewarnaan.

2.      Dilakukan tes menggunakan kertas saring dan metil alcohol

a.       Meletakkan kertas saring  di atas gelas supaya bagian tengah kertas saring tidak tersentuh apapun.

b.      Meneteskan 1 – 2  stock giemsa pada kertas saring, menunggu sampai meresap dan melebar, kemudian meneteskan 3–5 tetes metil alcohol absolute dipertengahan bulatan giemsa satu persatu dengan jarak waktu beberapa detik, sampai garis tengah giemsa menjadi 5 – 7 cm maka akan berbentuk bulatan biru  (metilen blue) di tengah, lingkaran cincin ungu ( metilen azure ) berada di luarnya, serta lingkaran tipis warna merah ( eosin ) dipinggir sekali.  Jika warna ungu atau merah tidak terbentuk berarti giemsa sudah rusak dan tidak boleh dipakai lagi (Depkes RI, 1993).

Pewarnaan sediaan darah sediaan darah tebal biasanya di hemolisis terlebih dulu sebelum pewarnaan, sehingga parasit tidak lagi tampak dalam eritrosit. Kelebihan dari sediaan ini yaitu dapat menemukan parasit lebih cepat karena volume darah yang digunakan lebih banyak. Jumlah parasit lebih banyak dalam satu lapang pandang, sehingga pada infeksi ringan lebih mudah ditemukan. Sedangkan kelemahan dari sediaan darah tebal bentuk parasit yang kurang lengkap morfologinya. (Safar, 2009).

a.       Ciri-ciri sediaan yang baik :

Sediaan yang dibuat harus bersih yaitu sediaan tanpa endapan zat pewarnaan. Sediaan juga tidak terlalu tebal, ukuran ketebalan dapat dinilai dengan meletakkan sediaan darah tebal di atas arloji. Bila jarum arloji masih dapat dilihat samar-samar menunjukkan ketebalan yang tepat. Selain menggunakan arloji dapat juga dengan cara meletakkan sediaan darah tebal di atas koran, kalau tulisan di bawah koran sediaan masih terbaca, berarti tetesan tadi cukup baik. (Sandjaja, 2007).

b.      Hasil sediaan darah tebal yang baik :

         Inti sel darah putih biru lembayung tua, granula biasanya tidak tampak, hanya granula eosinofil. Trombosit berwarna lembayung muda dan sering berkelompok. Parasit tampak kecil, batas sitoplasma sering tidak nyata. Titik Maurer dan titik Ziemen (P. malariae)  biasanya hilang. Titik Scuffner sering masih terlihat sebagai zona merah. Bentuk cincin sering tampak sebagai “koma”, “tanda seru”, atau “burung terbang”.

c.       Faktor yang harus diperhatikan untuk mencapai pewarnaan yang baik

1.      Kualitas dari stock  giemsa yang digunakan standar mutu

a. Stock giemsa yang belum tercemar air

b. Zat warna giemsa masih aktif

2.      Kualitas dari air pengencer giemsa

a. Air pengencer harus jernih dan tidak berbau

b. Derajat keasaman pengencer hendaknya berada 6,8 - 7 ,2 perubahan pH pada larutan giemsa berpengaruh pada sel-sel darah.

3.      Kualitas pembuatan sediaan darah

Dalam pembuatan sediaan darah tebal yang perlu diperhatikan adalah tebalnya sediaan. Ketebalan dikatakan memenuhi syarat apabila disetiap lapang pandang terdapat 10 – 20 sel darah putih.

4.Kebersihan sediaan darah

            Zat warna yang mengendap dipermukaan pada akhir pewarnaan tertinggal pada sel darah dan akan mengotorinya. Oleh karna itu pada akhir pewarnaan larutan giemsa harus dibilas dengan air yang mengalir .

5.      Syarat sediaan Kaca

Kaca sediaan dipakai untuk menempelkan darah yang sering kali diambil dari tempat yang jauh, sediaan darah ini kemudian diproses, diperiksa dan kemudiaan disimpan atau dicuci kembali, maka penting sekali penggunaan kaca sediaan yang baik dan bermutu. Syarat untuk kaca sediaan yang baik adalah :

ü  Bening atau jernih

ü  Permukaan licin, tidak tergores-gores

ü  Bersih ( bebas dari lemak, debu, asam, atau alkalis )

ü  Tebal antara 1,1 dan 1,3 mm

ü  Ukurannya sama (  Depkes RI,  1993)

d.      Prosedur pewarnaan darah tebal :

o   Teteskan darah pada sebuah slide bersih.

o   Tetesan darah dilebarkan sambil dengan kaca secara berputar, sampai menjadi sediaan darah dengan diameter 1 - 2 cm.

o   Biarkan mengering di udara .

o   Pengecatan sediaan darah tebal :

ü  Rendam apusan darah dalam air untuk melisiskan sel darah merah.

ü  Setelah darah lisis rendam atau genangi dengan giemsa selama 15-20 menit.

ü  Biarkan sampai kering, periksa sediaan darah dibawah mikroskop.

o   Pemeriksaan darah tebal dilakukan dengan cara :

ü  Siapkan mikroskup yang sudah dibersihkan dengan xylol.

ü  Pasang sediaan dengan perbesaran 100x dengan diberi anisol.

ü  Catat hasil pengamatan.

e.       Hal-hal yang perlu diperhatikan pada pewarnaan giemsa :

o   Perhatikan agar metanol tidak mengenai sediaan tetes tebal karena akan membuat bagian tersebut terfiksasi dan hasil pewarnaan tidak sesuai dengan hasil yang diinginkan.

o   Hati-hati pada saat membilas sediaan tetes tebal karena bagian tersebut tidak difiksasi dan tidak menempel dengan kuat ke slide kaca.

C.     Alat dan Bahan

1.      Alat

a.       Mikroskop

b.      Camera

c.       Cawan Petri

d.      Pipet tetes

e.       Jarum

f.       Objek glass

2.      Bahan

a.       Darah manusia

b.      Giemsa

c.       Wright

d.      Alkohol

D.    Prosedur Kerja

1.      Disiapkan semua alat dan bahan yang dibutuhkan dalam praktikum.

2.      Tusuk jari dan diambil sedikit darah.

3.      Tempatkan setetes darah pada kaca objek.

4.      Dengan menggunakan  kaca objek kedua, Tarik setetes darah pada permukaan kaca objek, sehingga menyisakan selapis tipis darah pada kaca objek dengan kemiringan 45 derajat.

5.      Ditunggu hingga kering, kemidian ditetesi apusan darah dengan larutan wright dan didiamkan selama lima menit.

6.      Setelam lima menit, tetesi apusa darah dengan giemsa dan didiamkan selama sepuluh menit.

7.      Preparat apusan darah dicuci dalam air mengalir dan dikeringkan.

8.      Diamati preparat dengan menggunakan mikroskop.

9.      Mengamati macam-macam sel darah putih dan mengidentifikasinya.

10.  Menghitung banyaknyan sel darah putih yang terlihat  di luas bidang pandang, denagn perlakuan sepuluh bidang pandang sesuai denga nama sel darah putih.

11.  Mendokumentasikan sel darah putih yang terlihat dibawah mikroskop.

E.     Hasil Pengamatan

Tabel pengamatan sel darah putih (leukosit) manusia, dengan perlakuan sepuluh bidang pandang.

No	Jenis Leukosit	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	∑	%
1	Limfosit	1	2	0	1	3	1	1	0	1	1	11	37,9%
2	Neutrofil	0	1	1	2	1	0	3	2	1	0	11	37,9%
3	Basofil	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1	3,6%
4	Monosit	1	0	0	0	0	1	0	0	0	0	1	10,3%
5	Eosinofil	1	0	0	0	0	1	0	0	1	0	3	10,3%
	Jumlah	3	3	1	3	5	2	5	2	3	2	29	100%

Sel darah putih (leukosit) manusia, dengan perlakuan sepuluh bidang pandang.

Bindang Pandang ke-1	Bindang Pandang ke-2
Bindang Pandang ke-3	Bindang Pandang ke-4
Bindang Pandang ke-5	Bindang Pandang ke-6
Bindang Pandang ke-7	Bindang Pandang ke-8
Bindang Pandang ke-9	Bindang Pandang ke-10

F.      Pembahasan

Pada praktikum tentang apusan darah manusia kali ini  diharapkan mahasiswa dapat menidentifikasi berbagai macam bentuk sel darah merah putih pada manusia. Praktikum kali alat dan bahan yang kita butuhkan adalah mikroskop, camera, cawan petri, pipet tetes, jarum, objek glass, darah manusia, giemsa, wright dan alcohol.

Pada praktikum kali ini yang harus pertama disiapkan adalah semua alat dan bahan yang dibutuhkan dalam praktikum kemudian ditusuk jari dan diambil sedikit darah dan ditempatkan setetes darah pada kaca objek, dengan menggunakan  kaca objek kedua, Tarik setetes darah pada permukaan kaca objek, sehingga menyisakan selapis tipis darah pada kaca objek dengan kemiringan 45 derajat, ditunggu hingga kering, kemidian ditetesi apusan darah dengan larutan wright dan didiamkan selama lima menit.

Setelam lima menit, tetesi apusa darah dengan giemsa dan didiamkan selama sepuluh menit, preparat apusan darah dicuci dalam air mengalir dan dikeringkan da diiamati preparat dengan menggunakan mikroskop, yang diamati adalah macam-macam sel darah putih dan mengidentifikasinya dalam kelompok limfosit, neutrofil, basofil, monosit dan eosinosil. Kemudian menghitung banyaknyan sel darah putih yang terlihat  di luas bidang pandang, dengan perlakuan sepuluh bidang pandang sesuai dengan nama sel darah putih. Langkar teakhir adalah mendokumentasikan sel darah putih yang terlihat dibawah mikroskop.

Neutrofil adalah adalah bagian sel darah putih dari kelompok granulosit. Bersama dengan dua sel granulosit lain: eosinofil dan basofil yang mempunyai granula pada sitoplasma, disebut juga polymorphonuclear karena bentuk inti sel mereka yang aneh. Granula neutrofil berwarna merah kebiruan dengan 3 inti sel.

Eosinofil merupakan sel darah putih bergranulasit yang berfungsi untuk kekebalan tubuh. Limfosit adalah sejenis sel darah putih pada sistem kekebalan makhluk vertebrata. Ada dua kategori besar limfosit, limfosit berbutiran besar (large granular lymphocytes) dan limfosit kecil. Limfosit memiliki peranan penting dan terpadu dalam sistem pertahanan tubuh.

Pada praktikum apusan darah yang tampak bagian eritrosit (sel darah merah) dan leukosit . Sel darah merah merupakan salah satu komponen darah yang berbentuk padat, ukuran partikelnya sangat kecil. Mengandung hemoglobin yang berfungsi untuk mengikat oksigen. Eritrosit tampak berdiri sendiri dan berada dalam sebuh cairan yang disebut dengan plasma darah yaitu cairan tempat seluruh sel-sel darah. Untuk sel darah putih diantaranya limfosit, neutrofil dan juga eosinophil. Dengan praktikum apusan darah dapat mengetahui bentuk-bentuk darah. Diantara materi-materi padat darah terdapat cairan yang disebut dengan plama darah.

G.    Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan dapat disimpulkan sebagai berikut:

Apusan darah merupakan salah satu cara mengamati materi-materi yang ada dalam darah baik materi padat materi cairnya. Materi padat terdiri dari sel darah merah sel darah putih, keeping-keping darah. Setelah diamati menggunakan mikroskop tampak butiran-butiran dari eritrosit seperti gambar dibawah ini:

Saat pewarnaan preparat menggunakan larutan Giemsa harus ditunggu sampai kering terlebih dahulu baru dicuci dengan air mengalir sebab apabila belum kering tetapi sudah dicuci maka ketika diamati menggunakan mikroskop maka darah akan terlihat menggumpal. Eritrosit yang diamati berbentuk butiran-butiran kecil berwarna merah dalam jumlah yang banyak dan pada bagian tengahnya seperti terdapat lekukan.

Neutrofil adalah adalah bagian sel darah putih dari kelompok granulosit. Bersama dengan dua sel granulosit lain: eosinofil dan basofil yang mempunyai granula pada sitoplasma, disebut juga polymorphonuclear karena bentuk inti sel mereka yang aneh. Granula neutrofil berwarna merah kebiruan dengan 3 inti sel.

Eosinofil merupakan sel darah putih bergranulasit yang berfungsi untuk kekebalan tubuh. Limfosit adalah sejenis sel darah putih pada sistem kekebalan makhluk vertebrata. Ada dua kategori besar limfosit, limfosit berbutiran besar (large granular lymphocytes) dan limfosit kecil. Limfosit memiliki peranan penting dan terpadu dalam sistem pertahanan tubuh.

Pada praktikum apusan darah yang tampak bagian eritrosit (sel darah merah) dan leukosit . Sel darah merah merupakan salah satu komponen darah yang berbentuk padat, ukuran partikelnya sangat kecil. Mengandung hemoglobin yang berfungsi untuk mengikat oksigen. Eritrosit tampak berdiri sendiri dan berada dalam sebuh cairan yang disebut dengan plasma darah yaitu cairan tempat seluruh sel-sel darah. Untuk sel darah putih diantaranya limfosit, neutrofil dan juga eosinophil. Dengan praktikum apusan darah dapat mengetahui bentuk-bentuk darah. Diantara materi-materi padat darah terdapat cairan yang disebut dengan plama darah.

 

DAFTAR PUSTAKA

Kadaryanto, S.Pd. dkk, 2007. Biologi 3 Megungkap rahasia alam kehidupan. Yudhistira. Jakarta.

Kadaryanto, S.Pd. dkk, 2004. Biologi 2 Megungkap rahasia alam kehidupan. Yudhistira. Jakarta.

Frandson, 1992. Anatomi dan fisiologi manusia. gadjah mada university press.yogyakarta.

Kelley, R., 1995. Histologi dasar . EGC. Jakarta.

Pearce, E.,2004. Anatomi dan fisiologi manusia untuk paramedis. Gramedia pustaka utama.jakarta