PEMBUATAN PREPARAT ORGAN IKAN KOMET (Carassius auratus)

PERCOBAAN I

PEMBUATAN PREPARAT ORGAN IKAN KOMET (Carassius auratus)

A.    Tujuan

Agar mahasiswa dapat mengetahui cara pembuatan preparat dengan metode paraffin dari ikan komet (Carassius auratus).

B.     Dasar Teori

Tubuh hewan secara morfologi terdiri atas unit sel, dan masing-masing sel dengan mengadakan kesatuan dengan adanya substansi antar sel. Di dalam tubuh hewan sel-sel ini terdapat dalam kelompok yang secara struktural dan fungsional berbeda dengan kelompok sel yang lain. Kelompok-kelompok sel-sel tersebut dikenal dengan jaringan. Preparat awetan jaringan hewan adalah salah satu media pembelajaran Biologi yang sangat efektif. Dengan latar belakang seperti di atas, maka diharapkan kita dapat mengamati dan melihat preparat dengan menggunakan metode paraffin dengan pewarnaan tunggal (Sumardi, 2002).

Struktur suatu organisme terdiri dari bagian yang lunak dan keras. Perbedaan struktur inilah yang akan menentukan metode yang digunakan untuk membuat preparat. Struktur yang lunak umumnya mengunakan metode parafin (metode irisan). Metode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan hewan ataupun tumbuhan yang tipis. Bahan berupa organ atau jaringan yang lunak dibuat keras terlebih dahulu sebelum diamati dengan melewati beberapa tahapan. Sedangkan bahan yang strukturnya keras dilakukan dengan metode yang berbeda dapat langsung diiris yang sebelumya difiksasi dan dibekukan.

Banyak cara dalam pembuatan preparat hewan, diantaranya adalah dengan metode parafin. Metoda ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metoda ini. Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan.

Percobaan pembuatan preparat permanen dengan metode parafin dilakukan dengan beberapa tahapan, diantaranya pembiusan (narcose), pengumpulan (colleting/diseksi), fiksasi (fixation), aerasi, dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi (infiltration), penanaman (embedding), penyayatan (sectioning), afiksasi (affixing), pewarnaan (staining) dan penutupan (mounting).

Pembiusan (narcose) ialah proses yang khusus untuk preparat hewan bertujuan untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan berguna untuk mengambil organ hewan dalam keadaan hidup sehingga organ yang diambil tidak jauh dari keadaan ketika hidup. Hindari pembiusan yang berlebihan sehingga hewan tersebut mati. Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-kelenjar (endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya.

Pengumpulan (colleting/diseksi) merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Ketebalan jaringan yang diambil harus disesuaikan dengan larutan infiltrasi agar seluruh jaringan keras sehingga hasil yang didapatkan bagus. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses pencucian (washing). Pencucian agar organ yang dipilih bersih (bebas dari darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan) dengan menggunakan larutan fisiologis agar tidak terjadi perubahan struktur sel dan jaringan dari organ tersebut.

Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan. Jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis. Sedangkan tumbuhan cukup menggunakan aquadest. Pencucian yang tidak baik akan mengakibatkan organ tida transparan ketika proses clearing.

Mikroteknik terdapat beberapa jenis teknik dalam pembuatan praparat, yaitu: Whole mount, yaitu penyiapan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organ tubuh organisme secara utuh; Smear yaitu penyiapan sediaan preparat dengan cara dioleskan; Squash; Section; Marserasi. Jenis teknik tersebut digunakan tergantung kepada kebutuhannya masing-masing, Langkah-langkah yang perlu diperhatikan dalam pembuatan preparat awetan adalah fiksasi, dehidrasi, clearing (penjernihan), embedding, pencetakan, dan pewarnaan (Gunawan 2009:1).

Fiksasi merupakan suatu proses yang dilakukan untuk mempertahankan kondisi jaringan. Tujuan dari fiksasi adalah untuk mempertahankan morfologi sel seperti semula, untuk mencegah terjadinya otolisis, dan untuk mencegah pertumbuhan bakteri atau jamus. Beberapa jenis bahan yang biasa digunakan sebagai bahan penfiksasi suatu jaringan., yaitu formalin, alkohol, larutan carnoi, larutan zenker, larutan helly, larutan bouin, larutan susa, omium, dan glutaraldehyde (Sudiana 2005: 1).

Pencucian agar organ yang dipilih bersih (bebas dari darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan) dengan menggunakan larutan fisiologis agar tidak terjadi perubahan struktur sel dan jaringan dari organ tersebut. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai ialah NaCl 0.8-0.9%, Larutan Ringer ( NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas dan NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin). NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15 menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan menyebabkan pembengkakan sel (hewan).

Dehidrasi pada pembuatan preparat awetan bertujuan umenarik air dari dalam jaringan secara perlahan-lahan gara jaringan tidak mengalami pengkeruta. Bahan yang digunakan adalah etaol dengan konsentrasi yang dinaikan bertahap Setelah pendehidrasian, selanjutnya dilakukan proses clearing. Bahan yang biasa digunakan, antara lain xylol,toluol, kloroform, dan benzen. Bahan-bahan tersebut berguna sebagai mediator antara larutan dehidrasi yang digunakan dengan larutan embeding yang akan digunakan. Proses penghilangan larutan dehidran dalam jaringan yang disertai dengan proses infiltarasi larutan embedding ke dalam jaringan disebut sebagai impregnasi. (Sudiana 2005: 6).

Pewarnaan pada preparat dapat dibedakan menjadi dua jenis, yaitu pewarnaan umum dan pewarnaan khusus. Pewarnaan umum yaitu pewarnaan yang hanya untuk membedakan antara bagian inti dan sitoplasmanya. Jenis bahan yang iasa digunakan dalam pewarnaan umum adalah hematoksilin-eousin (HE). Pewarnaan khusus adalah pewarnaan yang digunakan untuk melihat satu macam jenis organel atau untuk membedakan jaringan tertentu. Beberapa metode yang digunakan dalam pewarnaa khusus adalah gomori, PAS (periodic acid schiff), imunohistokimia, dan apotag. Prinsip dari pewarnaan jaringan adalah brdasarkan pada afinitas antara zat warna dengan bahan yang diwarnai (Sudiana 2005: 17).

Pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. Motoda pewarnaan yang sering dilakukan dalam pembuata preparat metode parafin adalah metoda pewarnaan Hematoxilin-eosin. Seperti merupakan peraturan, hamatoxillin digunakan terlebih dahulu dan setelah melalui proses diferensiasi, maka barulah eosin digunakan. Pertukaran tempat keduanya tampaknya akan menimbulkan kesukaran, karena pewarna hematoxilin akan mewarnai lebih cepat dari pada pewarna paduannya yang umumnya berperan sebagai counterstain yang intensitas pewarnaanya dapat diatur tanpa mempengaruhi pewarnaan hematoxilin (Pahwadi, 2011).

Jaringan hewan dapat diambil dari berbagai jenis hewan selagi masih dalam keadaan hidup, setelah mengalami pembiusan maupun yang baru saja mati dan segera mungkin dimasukkan larutan fiksatif. Organ-organ yang halus sifatnya seperti hati, jantung, insang, usus pada ikan mas komet (Carassius auratus).

Ikan mas komet (Carassius auratus)

Kingdom         : Animalia

Filum               : Chordata

Kelas               : Actinopterygii

Ordo                : Chpriniformes

Famili              : Chyprinidae

Genus              : Carassius

Spesies            : Carassius auratus

Bentuk tubuh ikan komet agak memanjang dan memipih tegak (compresed) dimana mulutnya terletak di ujung tengah dan dapat disembulkan. Bagian ujung mulut memiliki dua pasang sungut. Diujung dalam mulut terdapat gigi kerongkongan yang tersusun atas tiga baris dan gigi geraham secara umum. Hampir seluruh tubuh ikan komet ditutupi oleh sisik kecuali beberapa varietas yang memiliki beberapa sisik. Sisik ikan komet termasuk sisik sikloid dan kecil. Sirip punggung memanjang dan pada bagian belakangnya berjari keras. Letak sirip punggung bersebrangan dengan sirip perut. Garis rusuk atau line literalis pada ikan mas komet tergolong lengkap berada di pertengahan tubuh dan melentang dari tutup insang sampai ke ujung belakang pangkal ekor.

C.     Alat dan Bahan

1.      Alat

a.       baki karton

b.      blok parafin berisi organ

c.       gelas pewarnaan

d.      kaca objek

e.       mikrotom

f.       pemanas preparat

g.      penutup kaca objek

h.      pinset, pipet tetes

i.        toples kaca.

2.      Bahan

a.       alkohol bertingkat mulai dari 30% hingga alcohol absolute

b.      aseton

c.       alizarin red S

d.      aquadest

e.       Betta splendens

f.       Carassius auratus (ikan mas komet)

g.      gliserin murni

h.      larutan campuran gliserin dengan KOH 1% (20% : 80%, 50% : 50%, dan 80% : 20%), larutan KOH 1%

i.        putih telur

j.        xylol.

D.    Prosedur Kerja

1.      Narkose

Dalam pembuatan preparat jaringan hewan dengan menggunakan metode parafin biasanya digunakan objek berupa mamalia, untuk itu perlu dilakukan proses untuk mematikan hewan yang bersangkutan. Maka biuslah hewan tersebut degan menggunakan cloroform.

2.      Sectio

Bersihkan bulu-bulu dan kotoran yang menempel pada alat atau organ yang akan dibuat preparat. Organ diiris kira-kira 3-5 mm dan luas kurang lebih 1 cm2, sehingga penetrasi fiksatif terjamin sampai menyeluruh bagian organ.

3.      Labelling

Flakon tempat organ yang akan difiksasi diberi label sesuai dengan jenis organnya.

4.      Fiksasi

Obyek yang diinginkan dipotong lalu difiksasi dalam larutan Bouin kurang lebih selama 12-24 jam.

5.      Dehidrasi

Setelah larutan fiksatif dibuang, diganti dengan alkohol 70%, 80%, 90% dan 96% masing-masing sebanyak 3x dan masing-masing selama 10 menit, dikocok dan overnight. Setelah itu, dimasukkan kedalam alkohol absolut selama 10 menit dan dikocok.

6.      Dealkoholisasi

Buang alkohol dan kemudian ganti dengan zat yang mudah mengusir alkohol, tetapi kemudian harus di bias dengan parafin. Yang dapat diguanakan sebagai clearing agent adalah aceton, benzol, toluol dan xilol. Clearing (dealkoholisasi) dilakukan paling lama 24 jam (overnight).

7.      Infiltrasi

Infiltrasi dilakukan dalam inkubator dengan temperatur kurang lebih 55ºC atau 60ºC. Sebelum masuk keparafin murni, maka potongan organ lebih baik dimasukkan kedalam campuran xilol:alkohol 1:1 terlebih dahulu.

8.      Penyelubungan

Buat kotak karton ukuran ±2x2x1.5 cm persegi. Pipet obyek dengan pipet pastur yang sudah dipotong bagian yang menyempit dengan cepat dan letakkan di kotak karton, tambahkan paraffin cair hingga kotak penuh. Kemudian biarkan blok di temperatur kamar hingga mengeras. Unrtuk pemakaian pipet sekanjutnya lewatkan di api terlebih dahulu untuk mencairkan paraffin yang menempel didinding pipet. Penyelubungan dilakukan pada parain dengan suhu 56ºC selama 12 menit.

9.      Pengirisan

Rapikan blok dan bentuk blok tersebut menjadi bentukan prisma. Set mikrotom dengan ketebalan 5-10µm. Ambil potongan seri dengan kuas, letakkan pada slide yang telah diberi Mayer Albumin dan ditetesi sedikit aquades. Panaskan slide tersebut diatas hot plate yang diatur bersuhu suam-suam kuku (34-40) sampai melekat erat.

10.  Pewarnaan

Masukkan preparat kedalam xylol selama 10 menit (xilol pada slide dihisap dengan menggunakan tissue hingga bener-benar kering). Kemudian letakkan atau masukkan kedalam alkohol absolut, 96, 90, 80, 70, 60, 50, 40 dan 30%. Jika telah selesai bersihkan dengan aquadest. Kemudian masukkan preparat kedalam larutan Hematoxylin selama 30 detik, celup kedalam aquadest dan kemudian cuci dengan air mengalir.

Jika telah selesai masukkan kedalam alkohol 30, 40, 50, 60 dan 70% masing-masing beberapa detik saja. Masukkan preparat kedalam larutan eosin selama 1-2 menit dan kemudian masukkan kedalam alkohol 70, 80, 90, 96% dan alkohol absolut. Sbelum dimasukkan kedalam xilol, alkohol dihisap hingga benar-benar kering. Masukkan kedalam xilol selama 20 menit.

11.  Mounting

Merupakan tahap pelekata. Slide ditetesi dengan enthelan dan kemudian ditutup dengan menggunakan cover glass. Letakkan slide diatas hot plate agar cepat kering.

12.  Labelling

Merupakan tahap pemberian label dari preparat yang kita buat. Hendaknya label memuat nama jaringan, tebal irisan, arah potongan, pewarnaan dan tanggal pembuatan.

E.     Hasil Pengamatan

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan Preparat dengan metode parafin sangat sulit diidentifikasi, hal ini dikarenakan hasil yang didapatkan tidak sesuai dengan yang diinginkan atau dengan kata lain proses metode paraffin ini terjadi kesalahan, penyebab kesalahan ini belum dapat diketahui dengan pasti, kemungkinan karena preparat yang sudah lama disimpan, dan mungkin dikarenakan proses pewarnaan yang dilakukan kurang sempurna, atau bahkan dikarenakan tidak mampunya saya membedakan bagian organ tersebut sehingga menyebabkan kebingungan saat proses identifikasi. Kesalahan ini juga tampak pada saat proses penyayatan, karena pada proses ini bahan dan paraffin tidak menyatu dengan baik sehingga bahan pada saat disayat keluar dari paraffin seperti benang-benang kering.

Pembuatan preparat dengan metode parafin ini menggunakan pewarnaan Hematoksilin-eosin. Hematoksilin bersifat basa dan memberi warna ungu sedangkan eosin bersifat asam dan memberi warna merah muda, namun hasil yang didapatkan tidak kontras sehingga hanya dihasilkan 1 jenis warna saja yaitu warna merah muda yang membentuk garis-garis memanjang.

Hasil pembuatan preparat organ ikan mas komet (Carassius auratus) dengan menggunakan metode paraffin.

Gambar organ lambung	Gambar organ lambung
Gambar organ usus	Gambar organ Ginjal
Gambar organ insang	Gambar organ hati

F.      Pembahasan

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan tentang proses pembuatan preparat dengan metode paraffin, Kualitas preparat dipengaruhi oleh tahap-tahap yang dilakukan diantaranya yaitu tahap pencucian, pada proses inilah yang membedakan pembuatan preparat pada tumbuhan dan hewan, jika pada tumbuhan dapat hanya menggunakan aquadest namun pada hewan harus digunakan larutan khusus, hal ini dikarenakan jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Menurut pendapat Rozikuliyeva (2012), bahwa pencucian yang tidak baik akan mengakibatkan organ tida transparan ketika proses clearing. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai ialah NaCl 0.8-0.9%, Larutan Ringer ( NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas dan NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin). NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15 menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan menyebabkan pembengkakan sel (hewan).

Proses pembuatan preparat hewan terdapat suatu tahap yang harus dilakukan yaitu proses pembiusan, hal ini berfungsi agar preparat yang dihasilkan lebih sempurna karena tidak akan bergerak pada saat proses sedang berjalan, selain itu juga pembiusan dilakukan karena menunjukan etika terhadap penggunaan hewan sebagai bahan uji penelitian. Menurut pendapat Anandari (2012), bahwa pembiusan (narcose) ialah proses yang khusus untuk preparat hewan bertujuan untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan berguna untuk mengambil organ hewan dalam keadaan hidup sehingga organ yang diambil tidak jauh dari keadaan ketika hidup.

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan tentang pembuatan preparat dengan metode parafin didapatkan hasil berupa penampang organ-organ mencit, namun terjadi kesulitan dalam pengamatan, sehingga tidak bisa menentukan bagian organ apasaja yang digunakan, hal ini dikarenakan warna dan bentuknya relatif sama. Menurut pendapat Kurniawan (2010), bahwa terdapat sebagian organ yang gagal menjadi suatu preparat, hal ini mungkin disebabkan kurangnya ketelitian dan keterampilan pada saat mengiris block parafin saat menggunakan mikrotom, sehingga lembaran pita jaringan yang didapatkan terlalu tebal dan sulit diamati di bawah mikroskop. Selain itu, sebagian preparat tidak dapat dikenali dengan jelas bagian mana yang digunakan dari bahan percobaan karena pada saat proses pewarnaan, pencucian dan pencelupan sediaan ke larutan alcohol terjadi kesalahan.

Pembuatan preparat mikroskopis biasanya menggunakan metode parafin karena organ ataupun jaringan dapat diamati dengan lebih jelas. Menurut pendapat Gunarso (1986), bahwa Metode paraffin digunakan untuk membuat preparat sayatan organ dalam bentuk mikroskopis. Paraffin sendiri membantu dalam membrikan bentuk dari sayatan organ yang digunakan agar mudah mengamati bagian-bagian yang ingin diamati dari preparat sayatan organ yang dibuat. Metode ini meliputi sejumlah proses yang harus dilakukan, mulai dari proses fiksasi, dehidrasi, infiltrasi, penanaman dalam paraffin, penyiapan pecimen padat, penyayatan, pewarnaan dan penutupan pecimen dengan cover glass.

Fiksasi merupakan suatu proses yang sangat penting, hal ini dikarenakan proses ini berfungsi untuk mempertahankan jaringan atau struktur yang lainya agar tidak mengalami perubahan. Menurut pendapat Kurniawan (2010), bahwa fiksasi berfungsi untuk mempertahankan bentuk jaringan sedemikian rupa sehingga perubahan-perubahan bentuk atau struktur sel atau jaringan yang mungkin terjadi hanya sekecil mungkin. Selain itu fiksasi berguna untuk meningkatkan indeks bias jaringan sehingga jaringan dapat terwarnai dengan baik. Hal ini karena proses fiksasi dengan membunuh sel tanpa mengubah posisi organel yang ada di dalamnya, dan juga untuk menghilangkan air yang ada dalam sel dan memperoleh hasil yang sempurna pada proses infiltrasi dan juga agar alkohol tersebut dapat menyerap air sedikit demi sedikit supayadapat menjaga agar tidak terjadi perubahan yang tiba-tiba terhadap jaringan.

G.    Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut:

1.      Pembuatan preparat hewan memakan waktu yang panjang karena masih mengunakan cara yang manual.

2.      Hasil pengamatan yang didapatkan dari preparat jaringan hewan dengan metode parafin sulit untuk dibedakan, sehingga sulit di amati jaringan apa yang digunakan sebagai preparat karena warna dan bentuknya sama.

3.      Kelebihan-kelebihan dari metode parafin, yaitu irisan dapat jauh lebih tipis,tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron.

4.      Kelemahan dari metode parafin, yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah.

5.      Pembiusan merupakan metode yang harus dilakukan pada pembuatan preparat hewan agar didapatkan hasil yang baik, dan juga menjaga etika terhadap penggunaan hewan sebagai bahan penelitian.

 

DAFTAR PUSTAKA

Darmadi Goenarso, dkk. 2005. Fisiologi Hewan. UT. Jakarta.

Abbas, M. 1997. Biologi . Yudistira. Jakarta.

Subowo, 1992. Histologi Umum . Bumi Aksara. Jakarta.

Campbell, Reece Mitchael. 2004. Biologi, jilid 3. Erlangga. Jakarta.

Frandson, 1992. Anatomi dan fisiologi hewan. gadjah mada university press.yogyakarta.

http://id.wikipedia.org/wiki/darah diakses di Samarinda 17 Desember 2015